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大肠杆菌测定新方法

 

发布日期:[2011/5/8 14:41:26]    来源:青岛至成生物技术有限公司

 
本文来源:http://www.asqtech.com/a/www.caac.gov.cn/

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    检测原理:
    大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中的大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
2.仪器设备与器具:
2.1 恒温培养箱:36±1℃。
2.2 1000ml三角烧瓶、1ml、10ml移液管。
2.3 接种针。
2.4 显微镜。
2.5 超净工作台。
2.6 玻片、酒精灯、洗耳球、试管架。
2.7 天平:感量0.01g。
2.8 灭菌釜。
2.9 培养皿(直径为90mm)、试管,经121℃、30分钟灭菌。
2.10试管夹、酒精灯、秒表、载玻片 3.培养基及试剂:
3.1 乳糖胆盐发酵管:按照制造厂家使用说明进行配制,灭菌。
3.2 伊红美兰琼脂平板: 按照制造厂家使用说明进行配制,灭菌。
3.3 乳糖发酵管: 按照制造厂家使用说明进行配制,灭菌。
3.4 革兰氏染色液。
3.4.1 结晶紫染色液:
结晶紫 1g
95%乙醇 20ml
1%草酸铵水溶液 80ml
将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
3.4.2 革兰氏碘液:
碘 1g
碘化钾 2g
蒸馏水 300ml
将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300 ml。
3.4.3 沙黄复染液:
沙黄 0.25g
95%乙醇 10ml
蒸馏水 90ml
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
3.5 生理盐水。
4.检验程序:
检样

稀释

乳糖胆盐发酵管,36±1℃,24±2hr

↓ ↓
不产气 产气
↓ ↓
大肠菌群阴性 伊红美兰琼脂平板,36±1℃,24±2hr

报告 ↓ ↓
革兰氏染色 乳糖发酵管,36±1℃,24±2hr

↓ ↓ ↓ ↓
G+ G-,无芽孢杆菌 产气 不产气
↓ ↓
大肠菌群阴性 大肠菌群阴性
↓ ↓ ↓
报告 大肠菌群阳性 报告

5.测定方法:
5.1 检样稀释:
5.1.1 以无菌操作将检样25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌塑料烧杯中,经充分振摇成1:10均匀稀释液。
5.1.2 用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml,注入含有9ml灭菌生理盐水的 试管中,振摇成1:100稀释液。
5.1.3 重复5.1.2的操作,使成1:1000稀释液。
5.2乳糖胆盐发酵试验:根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择二个稀释度,每一稀释度接种3管,接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管。1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。然后置于36±1 ℃培
养箱内,培养24±2hr,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌
群阴性;如有产气者,则可按以下程序进行。
5.3分离培养:将产气的发酵管分别接种于伊红美兰琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养24hr后取出,观察菌落形态,并作革兰氏染色。
5.4证实试验:在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色同时接种乳糖发酵管,置于36±1℃温箱内培养24±2hr,观察产气情况。乳糖发酵管产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
5.5报告:根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100ml(g)大肠菌群的最可能数。
食品中金黄葡萄球菌的检测方法
金黄色葡萄球菌是一种引起人类和动物化脓感染的重要致病菌,也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一。本菌广泛分布于自然界,如空气、土壤、水及其它环境中。在人类和动物的皮肤及外界相通的腔道中,也经常有本菌存在。据报导,在正常人群中的带菌率可达30%~80%,其中皮肤带菌率为8~22%,鼻腔和咽喉部等上呼吸道的带菌率在40~50%以上,因此其可通过各种途径和方式,尤其是经工作人员的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黄葡萄球菌能产生肠毒素,故一旦细菌污染食品,并在合适的温度环境下,细菌可以大量繁殖并产生肠毒素,从而引起消费者食物中毒。
由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒,在世界各国都极为普遍。特别是在北美及欧洲等地区发病率更高。在上述这些国家中,每年有金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病例,仅次于沙门氏菌,而在细菌性食物中毒病例排到第2~3位,有此而造成的经济损失也相当惨重,在我国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病例也时有报导,所以目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。
我国对金黄色葡萄球菌目前采用的方法是以国家标准GB.4789-10-84及检验检疫系统行业标准SN.0172-92作为依据。整个检测过程获得最终结果须时5天左右,既费时又费力,并造成货物积压,也影响货物的及时出运,并使货主的仓储成本提高,造成较大的经济损失。
多年来很多食品微生物实验室都在探索和寻找一些准确性高,并快速的检测方法,最近我们分别从美国3M公司和法国生物梅里埃公司获得两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌的培养基,其名称为:
① Petrifilm RSA. Count Plate(由美国3M公司研制生产),是一种薄膜型快速检测金黄色葡萄球菌的计数平板。
② Baird-parker + RPF Agar.(由法国生物梅里埃公司研制生产的用Baird-Parker琼脂加免血浆纤维蛋白原的金黄色葡萄球菌检测计数平板)。
原理:Petrifilm. RSA. 测试薄膜是由二部分组成。第一部分是由黄金色葡萄球菌培养基片,此培养基中含有经修正的Barid-Parker,营养成分加上以冷水可溶解的胶质。第二部分是一种耐热核酸酶(TNase)反应片,含有DNA及甲苯胺兰 ( Toluidine Blue - O )及四唑指示剂 (Tetraeolium)。此指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌耐热核酸酶的存在。
耐热去氧核糖核酸(deoxyribonulcas Dnase)为产毒金葡菌之典型特征,此酶非常耐热,在100℃加热30min,不易丧失活性,在130℃之下,其D值为16.6min,此酶之分子量为16800,等电点PH为9.6,耐热去氧核糖酸与检测血浆凝固酶相似,是一种鉴定金黄色葡萄球菌的方法,在Petrifilm. RSA 检测片上,耐热DNA酶反应看起来,呈粉红色环带包围着一个红色或兰色的菌落。
Petrifilm.RSA检测片,必须与Peyrifilm耐热核酸酶反应片一起使用,单独使用将不会显示菌落,因为具有辅助计数菌落的指示剂是在反应片上,而不是在Petrifilm.RSA检测片上。
Baird-parker + RPF agar,这一培养基中含有丰富的营养成分,其中以氯化锂代替亚碲酸钾,使菌落颜色呈黑色,RPF补充有兔血浆和牛纤维蛋白原,以便检测凝固酶活力,胰酶可以抑制全部或部分围绕凝固酶阳性菌落周围沉淀晕环纤维蛋白的溶解,因此凡存在血浆凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌,将在培养基中呈现有晕环的黑色菌落,即可确认,并作计数。

实验实施
材料和方法:
本次实验采用以下3种试剂:
1. 美国3M公司提供的Petrifilm. Rapid. S. aureus Count Plate.
2. 法国生物~梅里埃公司提供的Baird-Parker + RPF agar .
3. 实验室自配Baird-Park琼脂(英国Oxoid)及新鲜兔血浆。

菌种来自美国菌种保存中心(America TyP Culture Collection)。金黄色葡萄球菌共10株菌株,其菌号分别为:
ATCC 27661 ATCC 27664 ATCC 13565 ATCC 51704
ATCC(K) 12600 ATCC(R) 65389 ATCC 25923 ATCC 29213
ATCC 8095 ATCC 12598
非金黄色葡萄球菌菌种5株,其菌号分别为:
ATCC 51813 (大肠杆菌)、ATCC 624 (无乳链球菌)、ATCC 51816 (阴沟肠杆菌)、ATCC 6051 (枯草杆菌)、ATCC 49214 (肠炎沙门氏菌)、自然食品检样,任意购自市场。
本次实验是以同一测试样品经均质并通过无菌生理盐水作10倍递增稀释后取1至2个稀释度同时接种上述三种培养基作平行实验,在取得最终结果后相互进行比对。
上述三种培养基的接种方法是按生产商所提供的使用说明进行操作,另外Baird-Parker Agar 培养基是按SN0172-92标准进行操作。
A、 本次实验共测试已知标准菌种共15株,其中葡萄球菌10株,其他菌种5株(包括大肠杆菌、阴沟肠杆菌、肠炎沙门氏菌、枯草杆菌和无乳链球菌)。
B、 测试自然食品检样共101只(其中包括肉11只、肉类14只、水产品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只)。

结果:
A、 被检菌种10株,金黄色葡萄球菌在三种培养基上都能检出生长情况良好,同一稀释度的菌液,除个别菌株外在3种培养基计数检测结果基本都在一个数量级上,无显著差异。而5株非金黄色葡萄球菌的菌株在三种培养基上全部不能生长。
B、 自然食品检样共接种101只,每一检样同一稀释浓度分别同时种三种培养基,最终共检出金黄色葡萄球菌45只,占全部检样的44.5%,其中Petrifilm RSA 检出阳性结果为42只,占全部阳性检样的93.3%,Baird-Parker+RPF Agar. 检出阳性结果26只,占全部阳性检样的57.7%。Baird-Parker. Agar 检出阳性结果32只,占全部阳性检样的71.1%。

讨论
1. 用15株标准菌在3种培养基中的检测,10株金黄色葡萄球菌以同一浓度接种,结果生长良好,其最终计数基本一致,定位在同一数量级,5株非金黄色葡萄球菌接种上述三种培养基全部不长,说明上述三种培养基对金黄色葡萄球菌选择良好。
2. 以101只自然样品同一均质稀释液,同时接种三种培养基,从最终结果来看,对金黄色葡萄球菌的阳性检出率为44.5%
3. 从检测程序来年,Petrifilm. RSA及Baird-Parker+RPF. Agar. 都在样品接种后28~30h观察结果,并不必再做证实试验,而如以Baird-Parker Agar检测,须在接种后48h观察平板,并挑取可疑菌落转种到营养肉汤中,在经18-24h后做血浆凝固酶或耐热DNA酶试验进行证实,最终计数,前后约须80h。
4. 从本次试验中观察,使用上述三种培养基对食品中金黄色葡萄球菌含量的直接计数检测,其样品接种液的含量拟控制在100个/ml以内,比较容易分清并计数,如菌量过浓,则将会影响最后的读数,因此对新送的被检样品,如在不了解污染的情况下一般必须要做2个以上的稀释度,同时分别接种,才能获得较为满意的结果。
而在Baird-Parker+RPF Agar及Baird-Parker. Agar接种时必须将1ml样液作三只平板涂布(0.3、0.3、0.4ml)这样就会造成手续繁琐试剂消耗较大,但Baird-Parker. RPF. 培养基也可以1ml样液作倾注培养,并作计数。
5. 在整个测试过程中,我们发现,按使用说明对Petrifilm. RSA. 及Barid-Parker+RPF. Agar,操作规定在接种24h后观察结果,此时往往由于菌落长得经较小,特征瓜不明显,但如果继续放置一夜以后金葡萄菌落特征明显,并可能会经第一天观察数量有所增加,这样可以提高检测结果的可信度。
6. 由于对上述两种培养基的试用期间我们尚未获得供应商的报价,故无法测算每一样品的测试成本价格。但可以予计上述两面种快速检测培养基的耗材费用要高于常规经典方法(Baird-Parker Agar)的费用。
7. 通过本次实验,我们感到使用美国3M公司生产的Petrifilm. RSA Plate培养基和法国生物-梅利埃公司生产的Baird-Parker RPF. Agar培养基检测中的金黄色葡萄球菌。可以比目前常规检测方法时间可缩短一半。并可以明显节省大量人力。这完全符合实验室快速检测的要求,尤其是对基层较简陋的实验室条件中,更显其使用方便的优越性。

 

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